En el procés de realització d'estudis genètics, sovint ens trobem amb mostres d'ARN insuficients, per exemple, per estudiar petits tumors anatòmics orals, fins i tot mostres unicel·lulars i mostres de mutacions gèniques específiques que es transcriuen a nivells molt baixos a les cèl·lules humanes.Per descomptat, per a la prova de la COVID-19, si els hisops no estan al lloc adequat o no hi ha prou vegades durant el mostreig, la mida de la mostra serà molt baixa, per això la Comissió de Salut i Planificació Familiar va sortir fa dos dies i va superar la prova, i si el mostreig d'àcid nucleic no va prendre sis mostres, podeu informar-ne.
La sensibilitat del reactiu és important perquè tenim aquest o aquell problema, doncs, què podem fer per millorar la sensibilitat de la RT-PCR?
Abans de parlar de possibles solucions, esmentem dues grans complicacions amb la situació que acabem d'esmentar.
En primer lloc, ens preocupem per la pèrdua d'ARN quan només tenim poques poblacions cel·lulars a la nostra mostra.Si s'utilitzen mètodes tradicionals de separació i neteja, com el mètode de columna o el mètode de precipitació d'àcids nucleics, hi ha una gran possibilitat que es perdin les poques mostres.Una solució és afegir una molècula portadora, com ara l'ARNt, però encara així, no hi ha cap garantia que el nostre experiment de recuperació estigui bé.
Aleshores, quina és una millor manera?Una bona opció per a cèl·lules cultivades o mostres microanatomiques és utilitzar la lisi directa.
La idea és dividir les cèl·lules durant 5 minuts, alliberar l'ARN a la solució, després aturar la reacció durant 2 minuts, afegir el lisat directament a la reacció de transcripció inversa perquè no es perdi ARN i, finalment, posar directament l'ADNc resultant. a la reacció en temps real.
Però, què passa si, a causa d'un punt de partida limitat o d'una petita quantitat d'expressió gènica objectiu, podem reciclar tot l'ARN i encara no proporcionar prou plantilles per obtenir un bon senyal en temps real?
En aquest cas, el pas de preamplificació pot ser molt útil.
El següent és un esquema per augmentar la sensibilitat després de la transcripció inversa.Abans de començar, hem de preguntar aigües avall en quins objectius ens interessen, per tal de dissenyar cebadors específics per a aquests objectius per a la preamplificació.
Això es pot aconseguir creant una imprimació mixta amb fins a 100 parells d'imprimadors i un cicle de reacció de 10 a 14 vegades.Per tant, es necessita una Master Mix dissenyada específicament per a aquest requisit per preamplificar l'ADNc obtingut.
El motiu per establir el nombre de cicles entre 10 i 14 és que aquest nombre limitat de cicles garanteix l'aleatorietat entre els diferents objectius, la qual cosa és crucial per als investigadors que necessiten informació molecular quantitativa.
Després de la preamplificació, podem obtenir una gran quantitat d'ADNc, de manera que la sensibilitat de detecció a la part posterior millora molt, i fins i tot podem diluir la mostra i realitzar múltiples reaccions de PCR en temps real per eliminar possibles errors aleatoris.
Hora de publicació: 11-abril-2023